細胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學研究人員必須掌握的一項基本技能，是實驗成功與否的關(guān)鍵。所以，了解細胞培養(yǎng)的基本操作要領(lǐng)，對生物醫(yī)藥科研工作者，特別是對基礎(chǔ)研究工作者來說，顯得尤為重要。文章從實際操作的角度談談體外細胞培養(yǎng)操作要點。

一、試驗前的準備

一般細胞生長環(huán)境為5%的二氧化碳，37℃恒溫及飽和濕度。在細胞培養(yǎng)開始之前，實驗人員必須查閱資料，了解細胞培養(yǎng)的習慣，如貼壁、半貼壁、懸浮物等。理解細胞生長的營養(yǎng)條件，大多數(shù)細胞為10%胎牛血清+89%培養(yǎng)液+1%抗生su。培養(yǎng)基的種類當然很多，高糖、低糖、分化培養(yǎng)基、干細胞培養(yǎng)基等等。依據(jù)細胞生長條件，預選適宜的消耗材料，如促貼壁或低吸附培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。對這些細胞進行處理前，計算出這次處理所需的細胞生長培養(yǎng)基總量，并將生長培養(yǎng)基進行配比。

二、細胞消化

與懸浮細胞相比，貼壁細胞的傳代步驟較多，應避免不必要的細胞污染。傳代操作可以在細胞生長集中程度達到80-90%左右的時候進行。由于細胞生長具有濃度依賴關(guān)系，過或過早傳代都會影響細胞狀態(tài)。取細胞培養(yǎng)盒， PBS清洗2次。此時將細胞培養(yǎng)瓶中的液體吸凈，可采用真空泵、移液管、一次性吸管等，但無論采用何種吸凈方法，均應避免操作手觸碰瓶口而造成污染，吸頭觸碰細胞面而造成細胞機械損傷。將液體吸凈，加入適量胰蛋白酶。胰酶不宜過多，只需少量滴在培養(yǎng)瓶上，傾斜培養(yǎng)可使細胞面覆蓋。細胞可以在這個時候放置在培養(yǎng)箱里，37℃條件下有利于胰蛋白酶的消化。大約2分鐘就可以消化了。自然地，有些細胞更容易消化，可能消化過程只需要30秒，如TC-1、MC-38等腫瘤細胞株；另一些則消化得更慢，如培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞(MSCs)。如何判斷細胞消化過程是否已經(jīng)結(jié)束？在倒置顯微鏡下我們可以看到細胞的形態(tài)，大多數(shù)的細胞由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形，可見細胞浮通過肉眼還可以直接觀察到細胞面從光滑到毛玻璃狀的變化。此可加入適量完全的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，基本上可加3-5毫升。加水輕輕吹吸后移至離心管進行離心，基本可將離心1000轉(zhuǎn)離心3分鐘即可分離細胞，轉(zhuǎn)速不宜過高，否則細胞碎片會隨離心下墜。離心性反應后棄上清液。此時可直接倒入，然后用移液槍清洗殘余液體。

三、接種

對上述細胞沉淀物進行重懸?？山柚谛郎u震蕩儀進行重懸，也可在重懸細胞前用手指輕彈離心管底部，再加入適量的培養(yǎng)基重懸，切忌直接加入培養(yǎng)基后用移液槍吹干。在2-3個培養(yǎng)瓶中，將重懸好的細胞全部分離，補全生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。約8-10毫升的培養(yǎng)液用于T25培養(yǎng)，20-25毫升的培養(yǎng)液用于T75培養(yǎng)。注射后，十字混勻，每日鏡下觀察細胞狀況。傳代比例可根據(jù)細胞生長規(guī)律進行調(diào)節(jié)，如快速生長的腫瘤細胞株，可按1:5甚至1:10的比例進行傳代。但原代培養(yǎng)的細胞生長較慢，可在1:2甚至2:3傳代。